重组杆状病毒及其构建方法,以及含该病毒的杀虫组合物
2020-01-15

重组杆状病毒及其构建方法,以及含该病毒的杀虫组合物

一种重组杆状病毒,它产生一种由杆状病毒多角体蛋白(PH)、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白(CP)和多管水母aequorea victoria绿色荧光蛋白(GFP)构成的重组多角体,该病毒的构建通过:将携带编码融合蛋白(其中PH、CP和GFP依次直接从N-末端到C-末端相连)的融合基因的转移载体和野生型杆状病毒同时引入昆虫细胞,并培育该细胞。该杆状病毒转移载体pColorBtrus通过下列步骤构建:用聚合酶链式反应合成来自质粒pGFP的编码GFP的DNA片段、来自野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的PH基因、以及来自携带有苏云金芽胞杆菌CrylAc基因的质粒pPN6.6的CrylAc基因;首先将编码GFP的DNA片段和PH基因,以编码GFP的DNA片段的5’末端和PH基因的3’末端连接的方式,插入杆状病毒表达载体pAcUW31,以及然后将CrylAc基因插入PH基因和编码GFP的DNA片段之间。重组病毒能高致病性的在短时间内杀死有害昆虫并且配备一种监测被感染昆虫的装置,从而能防止过度使用。

已用说明性方式描述了本发明,并可理解使用的术语是描述性的,而不是限制性的。

根据本发明的另一个方面,提供了一种杆状病毒转移载体pColorBtrus的构建方法,包括步骤:用聚合酶链式反应从质粒pGFP合成编码绿色荧光蛋白(GFP)的DNA片段;用聚合酶链式反应合成来自野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多角体蛋白(PH)基因,以编码绿色荧光蛋白的DNA片段的5’末端和多角体蛋白基因的3’末端连接的方式,将编码绿色荧光蛋白的DNA片段和多角体蛋白基因插入杆状病毒表达载体pAcUW31,来得到杆状病毒转移载体pColorPol,用聚合酶链式反应从携带有杆状病毒CrylAc基因的质粒pPN6.6合成CrylAc基因,以及将CrylAc基因插入多角体蛋白基因和编码绿色荧光蛋白的DNA片段之间。

实施例V:电镜观察免疫金标记的重组多角体通过在40-65%的蔗糖梯度中超离心如实施例III中的同样重组杆状病毒ColorBtrus和野生型AcNPV培养物,并分离56%区域处的AcNPV多角体和ColorBtrus多角体,从而制备样品。将样品固定在含有1%(w/v)仲甲醛的0.1M PBS(pH7.5)中,用0.1M甘氨酸(pH7.5)漂洗,脱水,然后包埋在Lowicryl K4M(polysciences)中。在镍载网上,用抗-GFP抗体,抗-CrylAc抗体和抗-PH抗体处理包埋多角体的超薄切片。将这些切片暴露于第二抗体,例如胶态金偶联的山羊抗-兔抗体(Biocell)中,用0.2%柠檬酸铅和2%乙酸铀酰染色,然后用透射电子显微镜(Hitachi M-600)观察。

实施例IV:重组多角体的蛋白质印迹分析用重组杆状病毒AcG,ColorPol和ColorBtrus,以实施例III的相同方式感染Sf9细胞。27℃培养后,在感染3日后通过4000xg离心5分钟收集细胞。用PBS洗涤并用5x样品缓冲液混合后,将细胞在100℃沸水浴5分钟,室温下放置片刻,然后在7,000xg离心5分钟而变澄清。在含SDS的3%聚集胶和10%聚丙烯酰胺分离胶上电泳细胞裂解物的上清液。将凝胶上泳出的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。在印迹后,膜与抗-GFP抗体(Clontech,目录号8363-2),抗-AcNPV PH抗体(汉城国立大学,应用生物和化学系,昆虫病理学和基因工程实验室所有)或抗Bt CrylAc抗体(汉城国立大学,应用生物和化学系,昆虫病理学和基因工程实验室所有)结合,然后与山羊抗-兔IgG碱性磷酸酶偶联物(Sigma)一起在室温下培育。

用抗-GFP抗体,抗-PH抗体和抗CrylAc抗体获得的蛋白质印迹,分别如图3a,3b和3c所示。如图所示,重组杆状病毒ColorPol和ColorBtrus产生的多角体是分别由分子量为60kDa的PH-GFP融合蛋白和PH-CrylAc-GFP构成的。

本发明使用的GFP来自多管水母Aequorea victoria,是一种紫外线激发时发绿光的非常稳定的蛋白。GFP是为了控制有害昆虫的目的而被引入的(Chao等,自然,380,369-397,1996)。在本发明中,GFP用来促进检测和监测被重组杆状病毒感染的幼虫及其在生态系统中的分布,从而防止该杀虫剂被不谨慎的滥用。

Description

发明内容

实施例VI:对用蚕肠道液处理的重组多角体进行蛋白印迹分析将来自用电流休克的五龄蚕呕吐出的肠道液,等体积地加到野生型AcNPV多角体、重组ColorBtrus多角体和Bt CrylAc蛋白中,并在室温下放置5分钟。将这些样品进行10%SDS-PAGE,然后使用抗-Bt CrylAc抗体如实施例IV中同样方式进行蛋白质印迹分析。对于模拟感染,使用了水。